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APPLICATIONS

磁性微球时间分辨免疫技术定量检测糖类抗原199的研究

研究背景

 糖类抗原(CA)199是乳酰-N-岩藻五糖Ⅱ的唾液酸衍生物,是由5个糖单位组成的糖脂。通过病理学检查已证实CA199广泛存在于胎儿结肠、小肠、胃、胰和肝的细胞中。成人胃肠道器官和肺组织中可检测出微量的CA199,而成人唾液、精液、胃液、羊水、尿液、卵巢囊肿液,胰腺、胆囊、十二指肠的分泌物,以及其他含黏蛋白的体液中CA199的水平都很高,故常以血清或血浆为检测标本。

应用磁珠

NHS琼脂糖磁珠

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论文解析

CA199主要的检测方法包括免疫放射法(IRA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、电化学发光法(ECLIA)和时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)等。随着方法学的发展和对指标精确定量等要求的提高,其中一些方法的缺点也日益突显,如ELISA灵敏度不高,IRA有放射性污染,TRFIA自动化程度不高、反应时间长等。本文所建方法:将磁性微球(纳米磁珠)作为固相载体建立了检测CA199的磁珠时间分辨荧光免疫分析法(Nano-TRFIA),与其他检测方法相比较具有独特优势,首先NHS磁珠是以超顺磁性四氧化三铁(Fe3O4)为核,磁珠直径小,可以均匀地分散于液相中,反应体系可以暴露更多的结合位点,明显减小抗原-抗体反应的空间位阻,利于抗体与血清标本中特异度结合效率提高,且可提高检测的特异度及灵敏度,NHS磁珠具有超顺磁性,可通过施加外部磁场进行快速移动和分离,无需离心即可将免疫反应形成的免疫复合物与未结合的其他物质分开,经过洗涤液的充分洗涤,可以有效降低检测过程中的干扰,提高检测灵敏度和降低检测信噪比;免疫磁珠均匀分散于溶液中,与CA199抗体接触机会更大,从而加快免疫磁珠与CA199抗体的结合速率,反应时间只需要10min,大大提高了临床检测速度。


材料选择

 NHS偶联磁珠、缓冲液和封闭液为澳门新葡平台网址8883公司产品,2株抗体(抗CA199单克隆抗体B1和Eu3+-CA199-B7)及CA199参考标准、增强液和洗涤液由江苏省无锡市江原实业技贸总公司提供,CA199质控品由罗氏公司提供。牛血清蛋白(BSA)为Sigma产品。96孔微孔板系Nunc产品,去离子超纯水由本室自制,其他试剂均为国产分析纯。DR6606型时间分辨荧光免疫分析仪为广州达瑞公司产品。CA125、甲胎蛋白(AFP)标准液为达安基因公司产品。


结论

1.磁珠耦联的抗CA199-B1单抗的理化鉴定 

分别检测耦联反应前与反应后的溶液中鼠IgG抗体的量,加入纳米磁珠前检测值为28μg,反应结束分离去除纳米磁珠后上清液中检测值为4.8μg。标记率为23.2/28.0=82.86%。

2.纳米磁珠时间分辨免疫技术定量检测CA199的方法学评价
(1)灵敏度与稳定性 以零浓度点计数(CPS)均值(x)加2s后的计数率在标准曲线上所得到的相应值为检测的灵敏度,可知本方法的灵敏度为0.2U/mL。4℃保存的抗CA199-B1、Eu3+-CA199-B7冻干粉剂在3、6个月后分别测定,最高浓度点的结合率平均仅下降9%和6%,说明试剂盒稳定性较好,可较长时间保存应用。
(2)精密度和回收率 采用Nano-TRFIA测定罗氏质控血清中CA199低、高2种浓度的10次批内和批间变异系数(CV)分别为4.34%~5.33% 和4.99%~11.64%,见表1,平均CV 分别为4.84%和8.32%,符合批内CV<10%和批间CV<15%的要求。低、高2组质控品浓度分别为20.6、100.0U/mL,样品浓度为25.8U/mL,添加样品后实测样品浓度分别为43.46、128.51 U/mL,回收率分别为93.66%、102.15%,添加样品后的平均回收率为97.91%。

(3)特异度 采用Nano-TRFIA测量500U/mL水平的AFP时,测定值为1.5U/mL,测量浓度为250U/mL的CA125时测定值为1.2U/mL,说明该试剂盒与AP及CA125之间无交叉反应,抗体特异度比较好。

(4)临床血清标本分析 采用Nano-TRFIA检测90例本院就诊者的血清标本,并作比较。Nano-TRFIA和ECLIA两者结果基本相符。

【技术资料】

【技术视频】

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